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果蔬中农药残留快速定性初筛检测的相关问题技术探讨

作者:  转载自:  发布日期:2020/3/16

果蔬中农药残留快速检测仪相关问题技术探讨

农业产业化的发展使农产品的生产越来越依赖于农药、抗生素和激素等外源物质。我国农药在农产品的用量居高不下,而这些物质的不合理使用必将导致农产品中的农药残留超标,影响消费者食用安全,严重时会造成消费者致病、发育不正常,甚至直接导致中毒死亡。农药残留超标也会影响农产品的贸易,世界各国对农药残留问题高度重视,对各种农副产品中农药残留都规定了越来越严格的限量标准,使中国农产品出口面临严峻的挑战。

目前农药残留快速检测方法种类繁多,究其原理来说主要分为两大类:生化测定法和色谱检测法。其中生化测定法中的酶抑制率法由于具有快速、灵敏、操作简便、成本低廉等特点,被列为国家推荐标准方法(GB/T 5009.199-2003),已成为对果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行现场快速定性初筛检测的主流技术之一,得到了越来越广泛的应用。

农药残留危害

农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药母体、衍生物、代谢物、降解物和杂质的总称。造成蔬菜农药残留量超标的主要是一些国家禁止在蔬菜生产中使用的有机磷农药和氨基甲酸酯类农药,如甲胺磷、氧化乐果、甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷等。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品,虽然不会导致急性中毒,但可能引起人和动物的慢性中毒,导致疾病的发生,诱发癌症,甚至影响到下一代。

有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯是目前市场上最主要的3 类杀虫剂, 特别是有机磷类杀虫剂仍在生产上起主导作用, 更是菜农首选使用的一类杀虫剂。

随着农业产业化的发展,农产品的生产越来越依赖于农药、抗生素和激素等外源物质。我国农药在粮食、蔬菜、水果、茶叶上的用量居高不下,而这些物质的不合理使用必将导致农产品中的农药残留超标,影响消费者食用安全,严重时会造成消费者致病、发育不正常,甚至直接导致中毒死亡。农药残留超标也会影响农产品的贸易。

检测方法

控制农药残留对人体的危害,最为有效的方法之一是加强对食品中农药残留检测的力度。当今世界农残的检测分析向多残留、快速分析发展,要保证高通量的检测方法的准确性,需要有严格的农药残留确证技术。GC/MS是农药残留分析最广泛使用的方法,使用GC/MS进行农残分析,为了追求更高灵敏度和准确度,往往使用选择离子模式(SIM),依据保留时间和特征离子及离子比例关系对目标物进行确证。

GC/MS农残分析技术检测成本高、时间长,这就给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便,因此也催生出大量的快速农药残留的检测技术,常见的有化学速测法、免疫分析法、酶抑制法和活体检测法等.

(1)化学速测法,主要根据氧化还原反应,水解产物与检测液作用变色,用于有机磷农药的快速检测,但是灵敏度低,使用局限性,且易受还原性物质干扰。

(2)免疫分析法,主要有放射免疫分析和酶免疫分析,最常用的是酶联免疫分析(ELISA),基于抗原和抗体的特异性识别和结合反应,对于小分子量农药需要制备人工抗原,才能进行免疫分析。

(3)酶抑制法,是研究最成熟、应用最广泛的快速农残检测技术,主要根据有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酶的特异性抑制反应。

(4)活体检测法,主要利用活体生物对农药残留的敏感反应,例如给家蝇喂食样品,观察死亡率来判定农残量。该方法操作简单,但定性粗糙、准确度低,对农药的适用范围窄。

农药残留快速检测仪

农药残留快速检测仪是根据我国国情和市场需要而研制开的专用仪器。可以实现有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的现场快速检测。它可以广泛适用于各级食品安全监督部门、各级食品安全监测部门、蔬菜生产基地、蔬菜批发基地、农贸市场、食品超市、食品安全检测流动车、卫生防疫、环境保护等领域的蔬菜、水果中农药残留检测。

农药残留快速检测仪是根据国家标准(GB/T5009.199-2003)和农业标准方法(NY/T448-2001)中的酶抑制率法,结合快速检测方法研制的全新食品安全检测设备,能准确、快速检测出蔬菜、水果中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留量。

在一定条件下,有机磷和氨基甲酸类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用,其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下,酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解,其水解产物与显色剂反应,产生黄色物质,用分光光度计测定412nm下吸光度随时间的变化值,计算出抑制率,通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留。

结果判定:

以分光光度计测试(412nm波长)时,按下式计算抑制率:

抑制率(%)=[(ΔΑ0-ΔΑt )/ΔΑ0]×100

以农药残留快速测试仪检测时其抑制率一般可自动计算。若样品抑制率≥50%,表示样品农残超标,为阳性结果。阳性结果的样品需做2次以上重复检测,多次检测仍呈阳性需用气相色谱等仪器做进一步确认。

使用方法

1、开机

插上电源,打开仪器背面绿色电源开关,仪器显示开机画面,按画面提示操作,按下回车键,仪器开始自检,时间约1min。自检完毕后,仪器进入待机检测状态。

2、试剂配制(配套试剂:LS农残速测试剂)

2.1缓冲液:1包缓冲剂加入500mL蒸馏水或纯净水中,搅拌溶解制成磷酸缓冲液(pH7.6), 常温保存。

2.2显色剂:1显色剂25mL缓冲液溶解,使用时取100μL4℃冰箱保存。

2.3 :1瓶底物加12.5mL蒸馏水或纯净水溶解,使用时取100μL4℃冰箱保存;

或取1瓶底物加2.5mL蒸馏水或纯净水溶解 ,使用时取20μL4℃冰箱保存。

2.4胆碱酯酶:酶制剂无需配制,可直接取用,使用时取100μL4℃冰箱保存。

3、样品提取

2g果蔬样品(块茎类取4g),叶菜剪成25px左右见方的碎片,块茎类取横截面样品或取其表皮,放入三角瓶中,加入10mL缓冲液,振荡1~2min ,倒出提取液,静置2min,待测。若提取液混浊或杂质太多可过滤后再测。

4、测试

4.1 对照测试:于反应瓶中加入2.5mL缓冲液,再分别加入100μL酶液和显色剂,混匀,静置反应10min后加入100μL(20μL)底物,摇匀并立即倒入比色杯中,及时放入仪器的测量室第1通道,合上盖。按〈B〉键,显示屏下方延迟10s后,测量时间开始倒计时,计时完毕,显示屏显示吸光度增量(ΔΑ0)及抑制率。在进行对照测试时,2~8通道可同时进行样品测试。

4.2、样品测试:于反应瓶中加入2.5mL待测液,再分别加入100μL酶液和显色剂,混匀,静置反应10min后加入100μL(20μL)底物,摇匀并立即倒入比色杯中,及时放入仪器的测量室通道,合上盖。按〈M〉键,显示屏下方延迟10s后,测量时间开始倒计时,计时完毕,显示屏显示吸光度增量(ΔΑt)及抑制率。数据自动保存,如有需要按〈P〉键打印。

 

底物就是能和特异的酶结合的物质。底物为参与生化反应的物质,可为化学元素、分子或化合物,经酶作用可形成产物。一个生化反应的底物往往同时也是另一个化学反应的产物。比如,蛋白酶的底物就是蛋白质、脂酶的底物就是脂类、淀粉酶的底物就是淀粉。

 

胆碱酯酶(cholinesterase)是一类糖蛋白,以多种同工酶形式存在于体内。一般可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase),主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙,特别是运动神经终板突触后膜的皱摺中聚集较多;也存在于胆碱能神经元内和红细胞中。此酶对于生理浓度的Ach作用最强,特异性也较高。一个酶分子可水解3×10分子Ach一般常简称为胆碱酯酶。假性胆碱酯酶广泛存在于神经胶质细胞、血浆、肝、肾、肠中。对Ach的特异性较低,假性胆碱酯酶可水解其他胆碱酯类,如琥珀胆碱。

胆碱酯酶蛋白分子表面的活性中心有两个能与乙酰胆碱结合的部位,即带负电荷的阴离子部位和酯解部位。酯解部位含有一个由丝氨酸的羟基构成的酸性作用点和一个由组氨酸咪唑环构成的碱性作用点,两者通过氢键结合,增强了丝氨酸羟基的亲核活性,使之易于与乙酰胆碱结合; 胆碱酯酶有两类,它们都能水解乙酰胆碱。

临床意义:

增高:见于神经系统疾病、甲状腺功能亢进、糖尿病、高血压、支气管哮喘、Ⅳ型高脂蛋白血症、肾功能衰竭等。

减低:见于有机磷中毒、肝炎、肝硬化、营养不良、恶性贫血、急性感染、心肌梗死、肺梗死、肌肉损伤、慢性肾炎、皮炎及妊娠晚期等,以及摄入雌激素、皮质醇、奎宁、吗啡、可待因、可可碱、氨茶碱、巴比妥等药物。

对急性有机磷杀虫剂抑制的胆碱酯酶活力有不同程度的复活作用, 用于解救多种有机磷酸酯类杀虫剂的中毒。但对马拉硫磷、敌百虫、敌敌畏、乐果、甲氟磷(dimefox)、丙胺氟磷(mipafox)和八甲磷(schradan)等的中毒效果较差;对氨基甲酸酯杀虫剂所抑制的胆碱酯酶无复活作用。

乙酰胆碱,分子式CH3COOCH2CH2N+(CH3)3,是一种神经递质。在组织内迅速被胆碱酯酶破坏。乙酰胆碱能特异性地作用于各类胆碱受体,但其作用广泛,选择性不高。临床不作为药用,一般只做实验用药。在神经细胞中,乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶(胆碱乙酰化酶)的催化作用下合成的。主流研究认为人体内该物质含量增多与阿尔兹海默病(老年痴呆症)的症状改善显著相关。

植物

乙酰胆碱可引起根尖细胞耗氧速率的增加

乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶可能参与调控某些植物的种子萌发和幼苗早期生长

动物:

帕金森病又称"震颤麻痹",是一种中枢神经系统变性疾病,主要是因位于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性改变后,多巴胺的合成减少,抑制乙酰胆碱的功能降低,则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了"震颤麻痹"

黑质细胞发生变性坏死的原因迄今尚未明了, 可能与遗传和环境因素有关。有学者认为蛋白质、水果、乳制品等摄入不足,嗜酒、外伤、过度劳累及某些精神因素等,均可能是致病的危险因素。 原因不明的多巴胺减少导致的震颤麻痹,在医学上称为"原发性震颤麻痹",即帕金森病;

人的脑组织有大量乙酰胆碱,但乙酰胆碱的含量会随着年龄的增加而下降。正常老人比青年时下降30%,而老年痴呆患者下降更为严重,可达70%~80%。老年人脑组织乙酰胆碱减少,就给老年人吃富含胆碱的食品,发现有明显的防止记忆减退的作用。只要有控制地供给足够的胆碱,可避免60岁左右老年人记忆力减退。所以保持和提高大脑中乙酰胆碱的含量,是解决记忆力下降的根本途径。在自然界是,乙酰胆碱多以胆碱的状态存在于蛋、鱼、肉、大豆等之中,这些胆碱必须在人体内起生化反应后,才能合成具有生理活性的乙酰胆碱。另外,经常服用蜂王浆可以提高脑内乙酰胆碱的含量,从而促进激活脑神经传导功能,提高信息传递速度,增强大脑记忆能力,全面改善脑功能,并能延缓衰老。

酶联免疫吸附剂测定法,简称酶联免疫法,或者ELISA法。

它的中心就是让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测。

ELISA的试剂

在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:

⑴已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);

⑵酶标记的抗原或抗体(结合物);

⑶酶的底物;

⑷阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);

⑸酶联物(结合物)及标本的稀释液;

⑹洗涤液;

⑺酶反应终止液。

 

基本原理

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体

②酶标记的抗原或抗体

③酶作用的底物(显色剂)。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

 

用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP应用最广。

酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为:5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许0.02mol/LpH7.4PBS中,并对之透析过夜(4),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/LpH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥低温保存。



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