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呋喃妥因(AHD)代谢物酶联免疫试剂盒

作者:董万先  转载自:  发布日期:2017-6-28

呋喃妥因(AHD)代谢物酶联免疫试剂盒-食品安全试剂盒 > 抗生素残留检测试剂盒

1    概述

硝基呋喃类(Nitrofurans)抗菌剂是一种广效性抗生素,因价格较低廉且疗效佳,广泛用于畜禽及水产养殖。由于硝基呋喃类抗菌剂及其代谢物对人体长期食入有致癌、致畸胎等风险,1995年起欧盟(European Union)禁止硝基呋喃类抗菌剂在食用之畜禽及水产动物使用。

本试剂盒采用直接竞争酶联免疫一步法检测呋喃妥因代谢物AHD,经16小时的衍生及萃取步骤,ELISA检测部分不到1小时。

 


2    原理

样品中的游离呋喃妥因代谢物与酶标记的呋喃妥因代谢物竞争结合酶标板微孔中固相化的呋喃妥因代谢物特异性抗体,通过洗涤洗掉未结合的酶标记呋喃妥因代谢物,再通过酶的专一性显色剂显色根据显色的深浅来判断样品中呋喃妥因代谢物含量。根据竞争性原理,如果样品中的游离呋喃妥因代谢物量少,则酶标记的呋喃妥因代谢物结合的多,显色深,反之,则显色浅。检测时设置标准曲线,通过标准曲线测定样品中呋喃妥因代谢物的含量。

3    试剂盒组成

3.1呋喃妥因代谢物酶标板:96孔

3.2 呋喃妥因代谢物标准品:6瓶(1ml/瓶),分别是:

标准品

浓度ng/ml

0

0.03

0.1

0.3

1.0

3.0

3.3 呋喃妥因浓缩酶结合物:1瓶(101×,100ul)

3.4衍生试剂:1瓶(12ml)

3.5 浓缩缓冲液:1瓶(10×,30ml)

3.6 浓缩萃取/清洗液: 1瓶(10×,50ml)

3.7 底物溶液:1瓶(12ml)

3.8 终止液:1瓶(13ml)

3.9 说明书:1份

4    需要而未提供的材料

4.1 酶标仪(检测波长450nm,参考波长630nm)

4.2 微量移液器

4.3 前处理所需试剂及相关仪器

5    贮存

5.1 试剂盒贮存于2-8℃,切勿冷冻

5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存

5.3 该产品有效期为12个月

6    注意事项

6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。

6.2 试剂盒使用前,将试剂恢复至室温(20-25℃)。

6.3 不要使用过期试剂盒;不同批号试剂盒中的试剂不得混用;不同标准品、样品所用吸头不能混用。

6.4 避免所有试剂接触皮肤;混合试剂时应避免起泡。

6.5 衍生试剂乃配制于DMSO中,2-8 ℃保存会有结冰现象,若提供微温(30 ℃)的水浴将有助于加速溶解。此外,为避免DMSO挥发造成操作者不适,请于抽风柜内添加此试剂。

6.6 用剩余的测试条孔则放回铝箔袋,将封口封好后储存于2~8 ℃冰箱。

7    试剂配制

7.1 缓冲液:(萃取步骤中调节pH使用)

用去离子水将浓缩缓冲液以1:9之比例稀释

例:500ml缓冲液=50 mL浓缩缓冲液+ 450 mL去离子水

注:未用完的缓冲液放置2~8 ℃贮存。使用前请确实回温后使用,并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。 

7.2 萃取/清洗液:(样品萃取复溶、浓缩酶标记物稀释、清洗)

用去离子水将浓缩萃取/清洗液以1:9稀释

例:500ml萃取/清洗液=50 mL浓缩萃取/清洗液 + 450 mL去离子水

注:未用完的萃取/清洗液放置2-8 ℃贮存,使用前请确实回温后使用,并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。

7.3 酶标记物:

用萃取/清洗液将呋喃妥因浓缩酶结合物以1:100之比例稀释

例:3ml酶标记物=30ul浓缩酶标记物+ 3 mL萃取/清洗液

注:酶标记物请于每次使用前新鲜配制,未使用完的请丢弃。

 

8    样品处理程序

8.1水产品(鱼肉、虾肉)、鸡肉 (稀释倍数2):

I. 衍生反应

1. 1 g已混匀的样本于离心管中,加入4 mL H2O,0.5 mL 1 M HCl,100μL衍生试剂。

2. 振荡混合约1分钟。

3. 37 ℃烘箱,静置过夜(约16h)。

II. 萃取流程

1. 加入5 mL原倍浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL乙酸乙酯。

2. 振荡混合约1分钟。

3. 离心离心10分钟(3000 rpm)。

4. 2 mL上层液 (乙酸乙酯层)至10 ml玻璃试管

5. 50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干。

6. 于此玻璃试管中加入1 mL正己烷,先将残余物完全溶解,再加入0.8 mL原倍萃取/清洗液。

7. 振荡混合约1分钟。

8. 离心离心10分钟 (3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。

9. 取出下层溶液(水层)100ul用于实验

 

8.2.牛奶(稀释倍数8):

其他同水产,除一下两个步骤修改:

1.先离心10分钟(3000 rpm),除去上层脂肪,取下层液1mL置入离心管中,加入4 mL H2O 和 0.5 mL 1 M HCl及100μL 衍生试剂。

2.萃取步骤9:取出下层溶液(水层),再以原倍萃取/清洗液4倍稀释(即下层液100ul+原倍萃取/清洗液300ul),100ul用于实验

 

8.3 蜂蜜(稀释倍数8):

检品制备步骤与水产方法相同。

1.萃取流程步骤1的1M NaOH的添加量须调整为0.5mL。

2.萃取流程步骤9需改正:取出下层液(水层),再以原倍萃取/清洗液稀释4倍(即下层液100μL加原倍萃取/清洗液300μL)备用。

 

9    酶免分析步骤

9.1实验准备

9.1.1预先进行编号,标记标准品和样品的位置,推荐进行双孔检测(每次实验都须做标准曲线)

9.1.2使用前将所有试剂回升至室温,取所需数量的微孔条,将多余板条用试剂盒提供的自封袋重新密封同时排除里面空气,并立即放回2-8℃干燥保存

 

9.2分析步骤

9.2.1在标准品孔中加入100µl各标准品溶液,在各样品孔中加入100µl样品溶液;

9.2.2在所有孔中加入50µl的稀释好的酶标记物(见配液 7.3),轻微晃动反应板使之彻底混匀,室温下(20-25℃)温浴30min;

9.2.3甩干孔中液体,用洗涤工作液(250ul/孔)洗涤微孔板4-5次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体;

9.2.4洗涤程序完成后,立即用微量移液器在每个微孔中100µl底物液,轻微晃动使之混匀;

9.2.5室温下(20-25℃)温浴20min,每孔中加入100µl终止液,混匀,在450nm下检测吸光度,结果在5min内读取。

 

10 结果计算

10.1 计算百分吸光度值:将每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值除以标准品0ng/ml的吸光度值再乘以100%。

10.2以呋喃妥因代谢物浓度的对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线。根据样品百分吸光度值可从曲线上得到对应点的横坐标,即为呋喃妥因代谢物浓度的对数值,求得反对数即为测定液中呋喃妥因代谢物浓度C(ng/ml)。样本经过稀释时应乘以相应稀释系数。

 

11 试剂盒其他参数

本试剂盒灵敏度为0.03 ng/ml

水产、鸡肉检测下限为0.06ng/ml

牛奶、蜂蜜检测下限为0.24 ng/ml

试剂盒板内变异系数小于8%,板间变异系数小于15%

 

12 分析限制

本试剂盒检测为阳性的样品,应该用其他方法如GC/MS加以确认。



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