菌落总数测定、大肠菌群测定、常见致病菌检验方法

一.菌落总数测定

菌落总数是只食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。

菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

每种细菌都有它一定的生理特性。培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只是用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。

1.设备和材料

温箱:36±1℃;冰箱:0~4℃;恒温水浴:46±1℃;天平;电炉:可调式;吸管:容量为1ml和10ml，标有0.1ml单位的刻度;广口瓶或三角烧瓶:容量为500ml;玻璃珠:直径为5mm;平皿:皿底直径为9cm;试管:18*200mm;酒精灯;均质器或乳钵;试管架;灭菌刀或剪刀;灭菌镊子;酒精棉球;登记薄;玻璃蜡笔。

2.培养基和试剂

营养琼脂基

75%乙醇

生理盐水或其他稀释液:定量分装于玻璃瓶和试管内，灭菌。

二 大肠菌群测定

大肠菌群系指一群在37℃24小时能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

食品中大肠菌群数系以每100ml(g)检样内大肠菌z可能书(MPN)表示。

1.设备和材料

温箱:36±1℃;水浴:44±0.5℃;天平;显微镜;均质器或乳钵;温度计;平皿;试管;吸管;载玻片。

2.培养基和试剂

乳糖胆盐发酵管

伊红美蓝琼脂

乳糖发酵官

革兰氏染色液

三 常见致病菌检验---设备和材料/培养基和试剂

一、葡萄菌检验

食品中生长金黄色葡萄菌是食品卫生上的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食后能引起食物中毒。因此，检查食品中金黄色葡萄球有实际意义。

1.设备和额材料

显微镜;温箱:36±1℃;离心机;灭菌吸管、1ml、5ml、10ml;灭菌试管;载玻片;酒精灯。

2.培养基和试剂

7.5%氯化钠肉汤

i雪琼脂

Baird-Parker 氏培养基

肉浸液肉汤

灭菌盐水

兔血浆

二、溶血性链球菌检验

链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、尘埃、牛乃、粪便及人的咽喉和病灶中，根据其抗原结构，族特异性“C”抗原的不同，可进行血清学分群，按其在血平板上溶血的情况可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌和丙型溶血性链球菌。与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，其血清型90%属于A群链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化浓性炎症及呼吸道感染，还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发性流行。

1.设备和材料

温箱:36±1℃;水浴:36±1℃;显微镜;离心机;试管架;灭菌平皿;灭菌小试管;载玻片;灭菌吸管:1ml、5ml;灭菌镊子。

2.培养基和试剂

葡萄糖肉浸液肉汤

匹克氏肉汤

血琼脂

人血浆

0.25%氯化钙

灭菌生理盐水

杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。

三 、沙门氏菌检验

沙门氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或食品受到污染，均可使人发生食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占S位或第二位。

食品中沙门氏菌的含量较少，且常由于食物加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。故为了分离食品中的沙门氏菌，必须将增菌方法作某些改进。同时，由于分类学的改变，过去所称“亚利桑那菌属”现已与沙门氏菌的检验方法，包括五个基本步骤:(1)前增菌，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复其活力;(2)选择性增菌，使沙门氏菌得以来繁殖，而大多数的其他细菌受到抑制;(3)选择性平板分离沙门氏菌;(4)生化试验，鉴定到属;(5)血清学分型鉴定。

1.设备和材料

天平:称取检样用;均质器或乳钵;温箱:36±1℃、42℃;显微镜;灭菌广口瓶:500ml;灭菌三角烧杯:250ml;灭菌吸管:10ml;灭菌平皿:皿底直径9cm;灭菌小玻管:内径3mm，长约5cm;灭菌毛细吸管及橡皮乳头;载玻片;酒精灯;灭菌金属匙或玻璃帮;接种帮、镍铬丝;试管架。

2.培养基和试剂

缓冲蛋白胨水(BP)

氯化镁孔雀绿(MM)增菌液

四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液

亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液

亚硫酸铋琼脂(BS)

DHL琼脂

HE琼脂

SS琼脂

三糖铁琼脂(TSI)

蛋白胨水、靛基质试剂

尿素琼脂(DHTZ)

氰化钾(KCN)培养基

氨基酸脱羧酶试验培养基

糖发酵管

ONPG培养基

半固体琼脂

缓冲葡萄糖蛋白胨水、甲基红试剂、V-P试剂

丙二酸钠培养基

氯化酶试剂

革兰氏染色液

沙门氏菌因子血清

四 、志贺氏菌检验

志贺片菌在食品中的存活期较短，目前仍缺少理想的增菌方法，但其重要性不可忽视。

1.设备和材料

天平:称取检样用;均质器或乳钵;温箱:36±1℃;显微镜;灭菌广口瓶:500ml;灭菌平皿:皿底直径9cm;酒精灯;载玻片;灭菌金属匙或玻璃棒;接种棒;镍铬丝;试管架。

2.培养基和试剂

GN增菌液

HE琼脂

SS琼脂

麦康凯琼脂

伊红美蓝琼脂(EMB)

三糖铁琼脂(TSI)

半固体管

赖氨酸培养基

奔丙氨酸琼脂

西蒙氏柠檬酸盐琼脂

葡萄糖铵琼脂

糖发酵管

蛋白胨水、靛基质试剂

缓冲葡萄糖蛋白胨水、V-P试基、甲基红试剂

氧化酶试剂

革兰氏染色液

五 、病原性大肠艾希氏菌检验

引起腹泻的大肠艾希氏菌现知有三类，即产肠毒素大肠艾希氏菌、肠道侵袭性大肠艾希氏菌和肠道致病性大肠艾希氏菌。后者主要引起新生儿的腹泻。

大肠艾希氏菌所产生的肠毒素有两种，即不耐热的插关内毒素(LT)和耐热的肠毒素(ST)。

牛和猪的带菌是传播本菌引起事物中毒的重要原因。人的带菌亦可以污染食品，引起中毒。

1.设备和材料

天平:称取检样用;均质器或乳钵;温箱:36±1℃，42℃;水浴:100℃，50℃;显微镜;灭菌广口瓶:500ml;灭菌平皿:皿底直径9cm;灭菌试管:10*75mm;灭菌吸管:1ml，5ml;载玻片;酒精灯;灭菌金属匙或玻璃帮;接种帮、镍铬丝;试管架;塑料小管:内径1mm;注射器:0.25ml;灭菌的刀子、剪子、镊子;家兔:2kg体重;豚鼠:400~500g;小白鼠:1~4日龄。

2.培养基和试剂

乳糖胆盐发酵管

营养肉汤

肠道菌增菌肉汤

麦康凯琼脂

伊红美兰琼脂(EMB)

克氏双糖铁琼脂(KI)

糖发酵管

尿素琼脂(pH7.2)

缓冲葡萄糖蛋白胨水、V-P试剂

氰化钾(KCN)培养基

蛋白胨水、靛基质试剂

半固体琼脂

氧化酶试剂

革兰氏染色液。

六 、小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

小肠结肠炎耶尔森氏菌现已被列为肠杆菌科一个属。检验以检出该菌为主，用生化和血清学进行鉴定。该菌z适于生长温度为22~29℃。此菌可引起人的胃肠炎暴发，其症状表现与沙门氏菌食物中毒相似。

1.设备和材料

温箱:包括4±1℃、26±1℃、36±1℃三种;样品均质器;无菌平皿;

灭菌吸管:包括1ml、5ml及10ml三种，带橡胶乳头的吸管数支;PH试纸:PH范围为6.0~8.0;比浊管;显微镜;三角瓶;玻片染色缸或盘。

2.培养基和试剂

磷酸盐缓冲液

改良磷酸盐缓冲液

麦康凯琼脂

三糖铁琼脂

纤维二糖、山梨醇、鼠李糖、绵子糖、蔗糖、蜜二糖、侧金盏花醇、甘露醇或肌醇等发酵管

赖氨酸脱羧酶肉汤

鸟氨酸脱羧酶肉汤

Rustigian 氏尿素培养液

苯丙氨酸琼脂

动力试验培养基

营养明胶

胰蛋白胨水

缓冲葡萄糖蛋白胨水

氰化甲( KCN)培养基

克氏柠檬酸盐肉汤

细胞色素氧化酶试剂

革兰氏染色液

V-P试剂

无菌矿物油

氯化镁孔雀绿增菌液

七 、副溶血性弧菌检验

副溶血性弧菌是分布极广的海洋细菌，为引起事物中毒重要的病原细菌之一，尤其是在夏秋(6~9)季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，食用受此菌污染的食品常有中毒发生。本菌为革兰氏阴性、多形态、无芽胞杆菌，有嗜盐特性，在无盐的情况下不生长，30~37℃z适温度时增长较快，一般冬季不易检出。

1. 设备和材料

试管:20*200mm，15*100mm;吸管1ml，5ml，10ml;平皿:皿底直径9cm;三角瓶;试剂瓶;载玻片;酒精灯;接种环;温箱;显微镜;试管架。

2.培养基和试剂

氯化钠结晶紫增菌液

氯化钠蔗糖琼脂

嗜盐菌选择性培养基

3.5%氯化钠三糖铁琼脂

氯化钠血琼脂

嗜盐性试验培养基

3.5%氯化钠生化试验培养基

革兰氏染色液

甲基红试剂

靛基质试剂

V-P试剂

八 、肉毒梭菌及肉毒毒素检验

肉毒梭菌广泛分布于自然界特别是土壤中，易于污染食品，于适宜条件下可在食品中产生剧烈的向神经性毒素(称肉毒毒素)，能引起以神经麻痹为主要症状且病死率甚高的食物中毒(称肉毒中毒)。婴儿肉毒中毒虽属感染型中毒，但中毒病因有时也与食物或餐具肉毒梭菌污染有关。故检验食品特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒梭菌(例如罐头等密封保存的食品)，至为重要。

肉毒梭菌为专性厌氧的革兰氏阳性的粗大杆菌，形成近端位的卵圆形芽胞，在疱肉培养基中生长时，混浊、产气、发散奇臭，有的能消化肉渣。

肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、B、C、D、E、F、G等七个型，故肉毒梭菌的检验目标主要是其毒素。不论食品中的肉毒毒素检验或则肉毒梭菌的检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。

2.培养基和试剂

疱肉培养基

卵黄琼脂培养基

明胶磷酸盐缓冲液

肉毒分型抗毒诊断血清

胰酶:活力1:250

革兰氏染色液

九 、蜡样芽胞杆菌检验

蜡样芽胞杆菌是需氧性，能产生芽胞的革兰氏阳性杆菌。本菌在自然界分布较广，并易从各种食品检出，因食品在正常情况下就可能有此菌存在，如果它在食品中未能得到增殖，其存在便无意义。当摄入的食品每克中蜡样芽胞杆菌在百万以上常可导致食物中毒暴发。

蜡样芽胞杆菌所致食物中毒有两种类型。一种是以恶心、呕吐症状为主;另一种是以腹痛、腹泻症状为主。前者潜伏期较短，仅0.5~5小时;后者潜伏期较长，通常为6~16小时。本菌中毒可在集团中大规模暴发，也可以家庭暴发或散在发生。

1.设备和材料

温箱:36±1℃;冰箱:0~4℃。显微镜;恒温水浴:46±1℃;天平;电炉;可调式;吸管:容量为1ml和10ml，标有0.1ml单位的刻度，广口瓶或三角烧瓶:容量为500ml;玻璃珠:直径5~6mm;平皿:皿底直径为9cm。试管:18*200mm;载玻片;酒精灯;均质器或乳钵;试管架;接种环、针;L形涂布棒;灭菌刀、剪;灭菌镊子;酒精棉球;登记薄;玻璃蜡笔。

2.培养基和试剂

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基

肉浸液肉汤培养基

营养琼脂

酪蛋白琼脂

动力--硝酸盐培养基

木糖--明胶培养基

缓冲葡萄糖蛋白胨水

血琼脂

3%过氧化氢溶液

70%乙醇

革兰氏染色液

甲醇

0. 5%碱性复红染色液

甲萘胺-乙酸溶液

对氨基苯磺酸-乙酸溶液